前沿生物技术研究院王鹏程课题组建立植物保卫细胞蛋白组学研究方法
气孔是植物水分散失和气体交换的主要通道，也是许多病原菌入侵植物的通道。气孔保卫细胞是一类高度分化的表皮细胞，能灵敏地感受外界光、CO2、湿度以及病原菌侵染等，精确地调控气孔的开度，以适应不同的外界环境。保卫细胞是研究细胞分化与发育以及植物信号转导的模式系统。同时，由于保卫细胞较小，其基因组、蛋白组和代谢组的解析较其它植物细胞更为困难。
南方科技大学前沿生物技术研究院王鹏程教授课题组近日在Journal of Integrative Plant Biology杂志发表了题为“Cell type‐specific proteomics uncovers a RAF15‐SnRK2.6/OST1 kinase cascade in guard cells”（DOI: 10.1111/jipb.13536）的研究论文。该研究建立了单细胞蛋白组学研究体系，通过流式细胞仪分选特异表达pGC1-GFP荧光蛋白的保卫细胞，并通过微量样品质谱分析技术，对保卫细胞蛋白组进行了深入分析。这一研究从大约10,000个保卫细胞中鉴定超过4,500个蛋白，首次揭示了保卫细胞灵敏感受和响应外界信号的蛋白组基础。
图1. 基于细胞分选和质谱的保卫细胞蛋白组分析
2002年，Merlot等（2002）利用远红外成像技术发现OST1（OPEN STOMATA1）在气孔运动调节中的核心作用。OST1（也被称作SnRK2.6）编码一个保卫细胞特异表达的蛋白激酶。后续的研究证明OST1及其同源蛋白SnRK2.2和SnRK2.3是植物激素脱落酸（Abscisic acid, ABA）受体偶联途径的核心组分。非胁迫条件下，A亚组PP2C蛋白磷酸酶ABI1、ABI2等去磷酸化并抑制SnRK2.6的活性。干旱等环境胁迫诱导ABA的积累，与ABA受体PYR1/PYLs/RCARs蛋白形成复合体，抑制A亚组PP2C的活性，使SnRK2从被抑制的状态中释放出来。王鹏程课题组等发现B2和B3亚组RAF蛋白激酶通过磷酸化重新激活失活的SnRK2，介导了ABA和渗透胁迫对于SnRK2的激活（Lin et al., 2020; Soma et al., 2020; Takahashi et al., 2020; Katsuta et al., 2020; Lin et al., 2021）。
有趣的是， B2和B3亚组的RAF蛋白激酶在保卫细胞含量较少，显示可能有其它的蛋白介导了OST1的激活。王鹏程课题组从保卫细胞蛋白组中发现B1亚组RAF15在保卫细胞中高度富集，raf15单突变体即表现出气孔运动过程中对ABA不敏感的表型。进一步的研究发现，RAF15蛋白与OST1相互作用，通过磷酸化OST1激活环（Activation loop）中的保守磷酸化位点激活OST1，介导了ABA对气孔运动的调节过程。这一研究工作解析保卫细胞特异的RAF15-OST1信号途径，回答了OST1如何激活这一持续二十余年的难题，对保卫细胞ABA信号转导途径做出重要补充。
同时，研究人员通过保卫细胞蛋白组还发现黄酮代谢途径在保卫细胞中高度富集，也为四十多年前的发现Kaempferol和quercetin代谢产物在保卫细胞中特异积累提供蛋白组学解释（Vierstra et al., 1982）。
王鹏程研究组近年来主要聚焦于植物蛋白组学技术的开发，建立了高精度植物磷酸化蛋白组学技术（Wang et al., Mol Cell, 2018; Lin et al., Nat Commun, 2020），酪氨酸磷酸化组（Du et al., Stress Biol, 2022），蛋白激酶底物的高通量鉴定（Wang et al., PNAS, 2020），邻近标记技术（Wang et al., JIPB, 2022），S-nitrosylation定量蛋白组学技术（Qin et al., Nat Commun, 2023）。聚焦植物感受和应答渗透胁迫的分子机制，解析了RAF-SnRK2激酶级联途径在渗透胁迫和ABA信号途径中的核心作用（Lin et al., Nat Commun, 2020；2021）。王鹏程课题组博士后王宏亮、桑田、博士研究生王雨蓓是该论文的第一作者，王鹏程教授为通讯作者。华中农业大学胡红红教授、上海师范大学戴绍军教授、河南大学宋纯鹏和张学斌教授、中国农科院农业基因组研究所周绍群研究员、拜谱生物李荣霞博士等参与了这一工作。该研究得到了国家重点研发计划（2021YFA1300402）的资助。
文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jipb.13536
参考文献：
Katsuta, S., Masuda, G., Bak, H., Shinozawa, A., Kamiyama, Y., Umezawa, T., Takezawa, D., Yotsui, I., Taji, T., Sakata, Y. (2020). Arabidopsis RAF-like kinases act as positive regulators of subclass III SnRK2 in osmostress signaling. The Plant Journal 103: 634-644
Lin, Z., Li, Y., Zhang, Z., Liu, X., Hsu, C.-C., Du, Y., Sang, T., Zhu, C., Wang, Y., Satheesh, V., Pratibha, P., Zhao, Y., Song, C.-P., Tao, W.A., Zhu, J.-K., Wang, P. (2020). A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications 11: 613
Merlot, S., Mustilli, A.-C., Genty, B., North, H., Lefebvre, V., Sotta, B., Vavasseur, A., Giraudat, J. (2002). Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal 30: 601-609
Soma, F., Takahashi, F., Suzuki, T., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. (2020). Plant RAF-like kinases regulate the mRNA population upstream of ABA-unresponsive SnRK2 kinases under drought stress. Nature Communications 11: 1373
Takahashi, Y., Zhang, J., Hsu, P.-K., Ceciliato, P.H.O., Zhang, L., Dubeaux, G., Munemasa, S., Ge, C., Zhao, Y., Hauser, F., Schroeder, J.I. (2020). MAP3kinase-dependent SnRK2-kinase activation is required for abscisic acid signal transduction and rapid osmotic stress response. Nature Communications 11: 12
Vierstra, R.D., John, T.R., Poff, K.L. (1982). Kaempferol 3-o-galactoside, 7-o-rhamnoside is the major green fluorescing compound in the epidermis of Vicia faba. Plant Physiology 69: 522-525